Apêndice 1- Soluções, Corantes,Reagentes, Fixadores e Criopreservação
A. Anticoagulantes
1. Solução de Alseve (1941)
A solução de Alsever é um anticoagulante e preservador isotô nico do sangue, que
permite o armazenamento do sangue no refrigerador (4 a 50ºC) até 2 meses.
Fórmula Atual
| Glicose (C6H12O6) |
24,6 g |
| Citrato Sódico (Na3C6H5O7.2H2O)
|
9,6 g |
| Cloreto de sódio (NaCI) |
5,4 g |
| Água destilada-deionizada |
1.200 ml |
Fórmula Original
| Glicose (C6H12O6)
|
20,5 g |
| Citrato de sódio (Na3C6H5O7.2H2O)
|
8 g |
| Ácido cítrico (C6H8O7)
|
0,55 g |
| Cloreto de sódio (NaCI) |
4,2 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
- Dissolver os componentes em água destilada-deionizada, filtrar em
Seitz ou em Millipore. Estocar a solução anticoagulante no refrigerador à temperatura
de 4 a 5 ºC, até 6 meses.
Como Usar
- Partes iguais do anticoagulante e do sangue (v/v).
2. Soluções Ácido--Citrato Dextrose (ACD) e Citrato-Fospatodextrose (CPD)
| Solução |
ACD |
CPD |
| Ácido cítrico (C6H8O7) |
8 g |
3,27 g |
| Citrato de sódio (C6H5Na3O7) |
22 g |
26,3 g |
| Glicose (C6H12O6) |
24,5 g |
25,5 g |
| Diidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) |
|
2,22 g |
| Água destilada-deionizada (MQP) |
1.000 ml |
1.000 ml |
- Dissolver os componentes em água destilada-deionizada (MQP) e esterilizar pela
filtração em filtro Millipore de 0,45 µm de porosidade. Teste de esterilidade em
tioglicolato de sódio (18-24 horas-37ºC).
Como Usar
| Solução ACD ou CPD |
70 ml |
| Sangue total |
430 ml |
3. Solução de Citrato de Sódio
O citrato de sódio atua como anticoagulante pela formação de um sal
insolúvel com o cálcio, elemento necessário para a coagulação. A solução de citrato
de sódio (3,8%) é indicada para a estocagem de suspensões de eritrócitos.
| Citrato de sódio (Na2C6H5O7.2H2O) |
3,8 g |
| Solução salina 0.85% |
100 ml |
- Dissolver o citrato de sódio na solução salina fisiológica a 0,85%. Autoclavar
(121ºC por 15 min).
Como Usar
| Sangue total |
0,5 ml |
| Solução de citrato de sódio |
4,5 ml |
4. Solução de Heparina
| Heparina |
6,4 mg |
| Solução salina a 0,85% |
0,25 ml |
Como Usar
| Sangue total |
5 ml |
| Solução de heparina |
0,25 ml Q |
B. Corantes
1. Fucsina Ácida-Fast Green (Lawless, 1953)
| Acetona (C3H6O) |
50 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
50 ml |
| Formaldeido 37-40% (HCHO) |
10 ml |
| Solução de Schaudinn |
890 ml |
| Fucsina ácida (CI 42685) |
2,5 g |
| Fast green FCF (CI 42053) |
1 g |
Preparo: Misturar os quatro líquidos, e adicionar os dois corantes. Agitar
vigorosamente até a completa dissolução. Armazenar em frasco âmbar com tampa
esmerilhada.
2. Hematoxilina Ácida de Ehrlich (Gurr, 1956)
| Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290) |
2 g |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
10 ml |
| Álcool metílico (CH4O) |
100 ml |
| Glicerina (C3H8O3) |
100 ml |
| Água destilada-deionizada |
100 ml |
| Alúmen amoniacal (NH4Al(SO4)2.12H2O) |
3 g |
Preparo: Misturar o ácido acético glacial a 25 ml de álcool
metílico absoluto. Dissolver a hematoxilina nessa solução e adicionar os restantes 75
ml de álcool metílico e a glicerina. Dissolver o alúmen amoniacal em água destilada
quente e misturar as soluções. Deixar essa solução em contato com a luz solar ou a
37°C, durante várias semanas, para que a hematoxilina se oxide à hematina. Quando a
solução estiver amadurecida, filtrar em papel-filtro e armazenar em frasco âmbar.
Indicação: Coloração de trematódeos e cestóides.
C. Criopreservação de Protozoários
No Laboratório de Análises Parasitológicas da Faculdade de
Farmácia, UFRGS, é usado o método indicado por McMillan (1990) na rotina de
criopreservação de protozoários dos gêneros Trichomonas, Trichomonas e
Pentatrichomonas.
Meios, Reagentes e Material
1. Meio de Diamond (Trypticase-Yeast Extract-Maltose, TYM)
2. Dimetilsulfóxido ( DMSO) ( (CH3)2SO )
3. Acetona ( C3H6O )
4. Gelo seco, dióxido de carbono (CO2) sublimado
5. Nitrogênio líquido
6. Termômetro com escala até -50°C
Organismos
Culturas axênicas de tricomonas com 48 horas de crescimento.
Solução Criopreservadora a 5% (v/v)
| Dimetilsulfóxido (DMSO) |
5 ml |
| Meio de Diamond (TYM) |
95 ml |
Criopreservação
1. Transferir para criotubos (Biofreeze TM Vials, Costar cat.nº. 2027 ou 2028) 1 ml da
solução DMSO + TYM e 1 ml de cultura axênica de 48 horas de protozoários dos gêneros Trichomonas,
Tritrichomonas, Pentatrichomonas.
2. Imergir em acetona, com fragmentos de gelo seco, os criotubos presos a um bastão de
vidro.
3. Com agitação uniforme e contínua no sentido horário, baixar 1ºC por minuto,
até atingir a temperatura de -40ºC.
4. Mergulhar, imediatamente após, os criotubos em nitrogênio líquido (-196ºC).
4. Armazenar os criotubos em botijão criobiológico ( Taylor-Wharton-35 VHC) com
nitrogênio líquido.
Descongelação
1.Retirar os criotubos do botijão criobiológico, com nitrogênio líquido,
colocando-os em banho de água à temperatura de 37 ºC por 30 minutos.
2.Transferir, imediatamente, a mistura DMSO + TYM + células para o
meio de cultura TYM, e incubar a 37º C durante 48 a 72 horas.
3.Contar na câmara de Thoma o número de células mortas em relação as vivas.
Observação: O método de criopreservação descrito é indicado para Trichomonas
vaginalis, Pentatrichomonas hominis, Trichomonas gallinae, Tritrichomonas foetus e Tritrichomonas
suis.
D. Fixadores
1. Álcool-Formaldeido-Ácido Acético (AFA)
| Álcool etílico a 70% (C2H6O)
|
93 ml |
| Formaldeido 37-40% (HCOH) |
5 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
2 ml |
Indicação: Fixação de nematóides, trematódeos, cestóides e
acantocéfalos, a frio ou a quente (60-63°C). Os helmintos, depois da fixação em AFA,
por várias horas ou durante toda a noite, poderão ser armazenados nessa solução
fixadora, mas recomenda-se que sejam transferidos para a solução fixadora de
álcool-glicerinado. Trematódeos, cestóides e acantocéfalos devem ser mantidos, para
uma armazenagem longa, em álcool a 70%.
2. Álcool Glicerinado
| Álcool etílico a 70% (C2H6O) |
90 ml |
95 ml |
| Glicerina (C3H8O3) |
10 ml |
5 ml |
Indicação: Essa solução é um excelente fixador e conservador de nematóides. A
fixação deverá ser a quente (600C). A maior vantagem desse fixador é a
conservação indefinida desses vermes. A glicerina protege os nematóides da dessecação
no caso de evaporação do álcool.
3. Fixador de BLE
| Álcool etílico a 70% (C2H6O)
|
90 ml |
| Formaldeído 37-40% (HCOH) |
7 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
3 ml |
Indicação: Fixação de larvas e adultos de helmintos a quente
(70°C).
4. Líquido de Bouin ou Picroformaldeído
O ácido pícrico foi introduzido na técnica histológica por P.
Bouin. O fixador é um excelente coagulante de proteínas e misturado a outros fixadores
apresenta uma grande capacidade de penetração.
Solução aquosa saturada de ácido pícrico ( ~ 1,5 g%)
| (C6H2(NO2)3OH)
|
75 ml |
| Formaldeído 37-40% (HCOH) |
25 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
5 ml |
- O ácido pícrico cora os tecidos de amarelo. Para melhores
resultados, a cor amarela do ácido deverá ser removida antes dos helmintos serem
corados. A remoção é realizada através de vários banhos dos espécimes em álcool
etílico a 70%, a 35-400C, com algumas gotas de solução aquosa de carbonato
de lítio ou com uma pitada de hidrogenocarbonato de sódio.
Indicação: Fixação de trematódeos, cestóides e acantocéfalos a frio. durante
6-24 horas.
5. Fixador de Looss
| Álcool etílico a 70% (C2H6O)
|
50 ml |
| Glicerina (C3H8O) |
50 ml |
Indicação: Fixação de nematóides a quente (60° ).
6. Formaldeído
O formaldeido ou aldeído fórmico (HCOH) é o fixador mais utilizado.
Ele reúne as propriedades de um liquido fixador e preservador. Esse aldeído é um gás
apresentado em solução aquosa de concentração aproximada de 40%, cujo nome comercial
é "formol". Sua concentração pode variar de uma amostra para outra, devido à
volatilidade e à facilidade à polimerização ao paraformaldeído (trioxidometileno) ou
à oxidação ao ácido fórmico. Um precipitado branco na solução concentrada indica
polimerização, diminuindo a concentração. Deve ser protegido da luz. Apresenta
reação ácida, devido ao ácido fórmico Na prática, esse fixador é neutralizado pelo
hidróxido de sódio ou pelo carbonato de sódio. O formaldeido possui um grande poder de
penetração, os tecidos são fixados e enrijecidos rapidamente, mas não são
desidratados, mantendo o seu conteúdo de água e, portanto, não são inalterados. O
formaldeido é um excelente fixador de estruturas topográficas, para a caracterização
de lípidios sobre corte em congelação e para a pesquisa de substâncias amilóides.
Permite também uma pósfixação. As peças podem permanecer longo tempo no fixador sem
serem alteradas. O formaldeido não é recomendado para nematóides; entretanto, uma
solução diluída de formaldeido a 1-2% é indicada para matar vermes adultos de A.
lumbricoides. O uso de concentrações altas pode resultar na ruptura do
verme, devido a mudanças da pressão osmótica. Evitar inspirar os vapores do
formaldeido. Apesar dos autores de diversas técnicas especificarem a sua diluição de
formalina em termos do conteúdo de formaldeido, a diluição deverá ser feita a partir
do formaldeido comercial. Exemplo: para a solução de formaldeido a 10% (vlv) deverão
ser usados 10 volumes de formaldeido e 90 volumes de água destilada-deionizada.
7. Fixador de Gilson
| Ácido nítrico (HNO3) |
15 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2)
|
4 ml |
| Cloreto de mercúrio II ( HgCl2) |
20 g |
| Álcool etílico a 60% (C2H6O)
|
100 ml |
| Água destilada-deionizada |
800 ml |
Indicação: Fixação de trematódeos, cestóides e acantocéfalos a frio ou a quente.
Dependendo do tamanho, os organismos devem ser fixados de 15 minutos a 6 horas.
8 Fixador de Zenker
a. Solução Estoque
| Sulfato de sódio (Na2SO4)
|
1 g |
| Cloreto de mercúrio ( HgCl2) |
5 g |
| Bicromato de potássio (K2Cr2O7)
|
2,5 g |
| Água destilada-deionizada |
100 ml |
b.Fixador
| Solução estoque |
95 ml |
| Ácido acético glacial (C2H4O2) |
5 ml |
- Preparar o fixador imediatamente antes do uso. Usar a solução fixadora somente uma
vez, após a adição do ácido acético glacial. Fixação de 4 a 24 horas.
E. Soluções Salinas Balanceadas e Salinas Fisiológicas
1. Soluções de Hanks (HBSS) e Earle (EBSS)
HBSS EBSS
| Cloreto de sódio (NaCI) |
8,00 g |
6,80 g |
| Cloreto de potássio (KCl) |
0,40 g |
0,40 g |
| Cloreto de cálcio (CaCl2)
|
0,14 g |
0,20 g |
| Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O)
|
0,20 g |
0,20 g |
| Hidrogenofosfato dissódico(Na2HPO4.
12H2O) |
0,12 g |
- |
| Diidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) |
- |
0,12 g |
| Diidrogenofosfato de
potássio(KH2PO4) |
0,06 g |
- |
| Hidrogenocarbonato de
sódio(NaHCO3) |
0,25 ga |
2,20 gb |
| Dextrose (Glicose) (C6H12O6) |
1 g |
1 g |
| Vermelho de fenol 1%. |
1,60 mlc |
1,60 ml |
| Água destilada-deionizada |
1000 ml |
1000 ml |
Solução A
1. Diluir o vermelho de fenol em 100 ml de água destilada.
Solução B
2. Diluir o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o sulfato de magnésio, os
fosfatos dissódico, potássico, hidrogenocarbonato de sódio e a dextrose em 800 ml de
água destilada.
Solução C
3. Diluir o cloreto de cálcio em 100 ml de água destilada.
Soluções HBSS e EBSS
1. Misturar A + B + C. Esterilizar por filtração em Seitz ou em Millipore. Estocar à
temperatura de 4-5ºC.
a.Preparar uma solução estoque a 2.8% e adicionar no momento do uso.
b.Preparar uma solução estoque a 8,8% e adicionar no momento do uso.
c.Se a cor vermelha ficar muito fraca. adicionar 2 ml de solução aquosa de vermelho
de fenol a 1%.
2. Solução de Locke
| Cloreto de sódio (NaCI) |
9 g |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)
|
0,2 g |
| Cloreto de potássio (KCI) |
0,42 g |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) |
0,25 g |
| Glicose (C6H 12O6) |
2 g |
| Água destilada deionizada |
1.000 ml |
Dissolver o (CaCl2) em pequena quantidade de água e, após,
adicionar os sais remanescentes.
3. Soluçào de Ringer
| Cloreto de sódio (NaCI) |
8 g |
| Cloreto de potássio (KCI) |
0,2 g |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) |
0,2 g |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) |
0,1 g |
| Didrogenofosfato de sódio (NaH2PO4)
|
0,1 g |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) |
0,4 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
- Para preparar uma solução de Ringer estéril, dissolver os quatro
primeiros componentes em 900 ml de água e autoclavar (121ºC por 15 min).
Dissolver o NaH2PO4 e o NaHCO3 em 100 ml de água e
filtrar em Seitz ou Millipore. Misturar as duas soluções em condições de assepsia
total.
4. Solução Salina ou Solução Fisiológica
Solução salina, isotônica, é o termo aplicado para todas as concentrações da
solução de NaCI. Para uso biológico a concentração de 0,85-0,9% (m/v).
| Cloreto de sódio (NaCI) |
85 g |
90 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
1.000 ml |
- O cloreto de sódio deverá possuir grau de pureza,
"quimicamente puro", mínimo de 99,5%. Essa solução deve ser livre de
pirogênio para trabalhos com animais e com tecidos. A água destilada-deionizada usada
deve ser de preparação recente. Os módulos completos de purificação QpakTM (Milli-QR
Plus) da Millipore fornecem uma água isenta de íons, pirogênio e substâncias
orgânicas em níveis superiores a uma pentadestilação.
F. Soluções Tamponadas
Para facilitar a preparação das soluções tamponadas, são apresentadas adiante as
massas moleculares dos componentes das soluções mais usadas no Laboratório de
Parasitologia.
Massas Moleculares
| Ácido acético glacial (C2H4O2) |
60,05 |
| Ácido bórico [B(OH)3) |
61,84 |
| Ácido cítrico anidro [C3H4(OH)(COOH)3) |
192,12 |
| Ácido cítrico, cristais (C3H4(OH)(COOH)3.H2O) |
210,14 |
| Ácido clorídrico (HCI) |
36,465 |
| Ácido sulfúrico (H2SO4)
|
98,082 |
| Acetato de sódio (CH3COONa) |
82,04 |
| Acetato de sódio, cristais (CH3COONa.3H2O)
|
136,09 |
| Ácido fórmico (HCO2H) |
46,03 |
| Barbital, sódico (C8H11O3N2Na)
|
206,18 |
| Carbonato de sódio (NaCO3) |
106 |
| Cloreto de sódio (NaCI) |
58,45 |
| Citrato de sódio, cristais (C3H4OH(COONa)3.5H2O) |
348,17 |
| Citrato de sódio, cristais (C3H4OH(COONa)3.5
.1/2 H2O) |
357,18 |
| Citrato de sódio, granulado (C3H4OH(COONa)3.2H2O)
|
294,12 |
| Diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) |
136,07 |
| Diidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4.H2O) |
138,01 |
| Hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4.7H2O)
|
268,14 |
| Hidrogenofosfato dissódico anidro (Na2HPO4)
|
141,98 |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) |
84,02 |
| Hidróxido de sódio (NaOH) |
40,005 |
| Tetraborato de sódio (borax) (Na2B4O7.10H2O)
|
381,43 |
Solução Normal (N)
1. Ácido Clorídrico (HCI)
Concentrado: 37-38%.
Densidade 1.19 g / ml
a. Solução três normal (3N)
| HCI concentrado |
255 ml |
| Água destilada-deionizada q.s.p |
1.000 ml |
b. Solução dois normal (2N)
| HCI concentrado |
170 ml |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
c. Solução um normal (1N)
| HCI concentrado |
85 ml |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
2. Hidróxido de Sódio (NaOH)
a. Solução três normal (3N)
| NaOH |
120 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
b. Solução dois normal (2N)
| NaOH |
80 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
c. Solução um normal (1N)
| NaOH |
40 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
Solução Molar (M)
1. Ácido Clorídrico (HCl)
a. Solução três molar (3M)
| HCL concentrado |
109,5 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
b. Solução dois molar (2M)
| HCl concentrado |
73 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
c. Solução um molar (1M)
| HCI concentrado |
36,5 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
2. Hidróxido de Sódio (NaOH)
a. Solução três molar (3 M)
| NaOH |
120 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
b. Solução dois molar (2M)
| NaOH |
80 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p. |
1.000 ml |
e. Solução um molar (1M)
| NaOH |
40 g |
| Água destilada-deionizada q.s.p |
1.000 ml |
A. Solução Tampão de Fosfatos ( SÖRENSEN)
1. Preparação das Soluções Estoques
a. Solução 1 (Hidrogenofosfato de Sódio M / 15)
| Hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4) |
11,876 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
b. Solução II (Diidrogenofosfato de Potássio M / 15)
| Diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)
|
9.079 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
2. Solução Tampão de Sörensen
Para obter o pH especifico, misturar as quantidades indicadas deSoluções I e II M/15:
pH |
SOLUÇÃO I
Na2HPO4
M/15 |
SOLUÇÃO II
KH2PO4
M/15 |
| 5,906 |
1,0 ml |
9,0 ml |
| 6,239 |
2,0 ml |
8,0 ml |
| 6,468 |
3,0 ml |
7,0 ml |
| 6,643 |
4,0 ml |
6,0 ml |
| 6,813 |
5,0 ml |
5,0 ml |
| 6,979 |
6,0 ml |
4,0 ml |
| 7,168 |
7,0 ml |
3,0 ml |
| 7,318 |
8,0 ml |
2,0 ml |
| 7,731 |
9,0 ml |
1,0 ml |
B. Solução Tampão de Fosfatos 0,2 M
1. Preparação das Soluções Estoques
a. Solução I(Diidrogenofosfato de Sódio 0,2 M)
| Diidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4.H2O) |
27,6 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
b. Solução II (Hidrogenofosfato de Sódio 0,2 M)
| Hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4.7H2O)
|
53,6 g |
| Água destilada-deionizada |
1.000 ml |
2. Solução Tampão
Para obter o pH específico misturar as quantidades indicadas de
Soluções I e II 0,2 M:
| pH |
SOLUÇÃO I
NaH2PO4
O,2 M |
SOLUÇÃO II
Na2HPO4
O,2 M |
| 5,9 |
90,0 ml |
10,0 ml |
| 6,1 |
85,0 ml |
15,0 ml |
| 6,3 |
77,0 ml |
23,0 ml |
| 6,5 |
68,0 ml |
32,0 ml |
| 6,7 |
57,0 ml |
43,0 ml |
| 6,9 |
45,0 ml |
55,0 ml |
| 7,1 |
33,0 ml |
67,0 ml |
| 7,3 |
23,0 ml |
77,0 ml |
| 7,4 |
19,0 ml |
81,0 ml |
| 7,5 |
16,0 ml |
84,0 ml |
| 7,7 |
10,0 ml |
90,0 ml |
G. Soluções para Limpeza de Vidraria
Solução Sulfocrômica
Uso Geral
| Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)
|
1.000 ml |
| Solução aquosa saturada de bicromato de
sódio(Na2Cr2O7.2H2O) |
35 ml |
Preparação: Acrescentar o ácido sulfúrico sobre a solução aquosa saturada de
bicromato de sódio.
Para Limpeza de Lâminas
| Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) |
50 ml |
| Bicromato dipotássico (K2Cr2O7)
|
50 g |
| Água corrente |
500 ml |
- Essa solução é recomendada para limpar lâminas de microscopia. Deixar as lâminas
mergulhadas na solução de limpeza durante 24 horas; após, lavar em água corrente para
remover os resíduos da solução sulfocrômica, enxaguar em água destilada e em
solução de álcool etílico a 95%.Deixar secar à temperatura ambiente.
Referências
1. ALSEVER, J.B.& R.B. AINSLIE. 1941. New method for the
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